Авторы: Анастасия Чашникова, выпускница факультета биоинженерии и биоинформатики МГУ им. М.В. Ломоносова, преподаватель биологии АПО и «Коалиции»; Наталия Пушкина, студент кафедры вирусологии биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова, преподаватель кафедры биологии АПО.
Осенние листья и весенние цветы, шляпки грибов, шерсть животных — окрашенные объекты живой природы можно перечислять долго. Такое обилие цветов связано с тем, что организмы часто содержат пигменты. Пигменты — особые молекулы, избирательно поглощающие свет в определённой части спектра. Таким образом, вещества, придающие цвет живым организмам, — это пигменты, потому что именно при поглощении света с определенной длиной волны остается и отражается излучение с другими длинами волн, которое воспринимается глазом как цветное. Белый цвет — смешение всех цветов видимого спектра, черный цвет — отсутствие света в видимом спектре.
Способность поглощать свет — очень ценное качество для молекул, учитывая, что большую часть энергии наша биосфера получает от Солнца. Поэтому пигменты выполняют множество важных функций:
- Поглощают лишний свет, защищая другие молекулы — для это нужны, например. меланин и защитные каротиноиды.
- Поглощают свет и передают его энергию другим молекулам — так делают пигменты светособирающих комплексов растений, водорослей и фотосинтетических бактерий.
- Некоторые пигменты поглощают свет и преобразовывают его энергию в химическую — именно для этого нужны реакционные центры фотосистем.
- Наконец, пигменты могут окрашивать части тел растений и животных — для привлечения опылителей цветов и распространителей плодов, маскировки и прочего.
Многие из этих функций необходимы для процесса фотосинтеза, поэтому в данной статье мы сосредоточимся в первую очередь на фотосинтетических пигментах высших растений. Часть свойств является общей для всех пигментов, что позволит вам при желании легче разобраться в смежных темах. Например, вы можете обратить внимание на то, что для молекул пигментов характерно наличие протяжённых участков, на которых чередуются одинарные и двойные связи. Такие связи называются сопряжёнными и обладают особым электронным строением, необходимым для поглощения видимого света (рис. 2).
Хлорофиллы
Первая и наиболее важная группа — хлорофиллы. Они относятся к магнийпорфиринам: в центре молекулы находится атом магния, закреплённый в центре порфиринового кольца, к которому обычно присоединён фитольный хвост (см. рис. 3). Само порфириновое кольцо состоит из четырёх пиррольных колец, которые удерживают атом металла четырьмя атомами азота. Благодаря полярным связям порфириновое ядро хлорофилла обладает гидрофильными свойствами (то есть легко взаимодействует с молекулами воды), а вот фитольный хвост, прикреплённый к кольцу, неполярный и гидрофобный, поэтому хорошо взаимодействует с липидами. Это приводит к тому, что в хлоропластах хлорофилл хвостом закреплён в гидрофобной липидной мембране, а кольцом взаимодействует с белками. Хлорофиллы поглощают свет в красной и синей части спектра с длинами волн 640–700 нм и 400–450 нм соответственно (см. график на рис. 4).
Пигменты с подобной структурой встречаются и у прокариот, и у эукариот, однако нюансы строения молекулы отличаются в разных группах. В настоящее время известно около 10 хлорофиллов. Для эукариот важнее всего хлорофилл а, который в форме димеров (пар молекул) находится в реакционных центрах систем фотосинтеза растений и водорослей. Эти реакционные центры обозначаются как Р700 и Р680 (цифры соответствуют максимумам поглощения). Именно молекулы хлорофилла а осуществляют ключевой этап фотосинтеза, то есть преобразуют энергию квантов света в химическую.
Однако, чтобы преобразовать энергию света, её надо сначала уловить. Для более эффективного сбора света реакционные центры снабжены сложноорганизованными антенными комплексами. В этих антеннах молекулы пигментов передают световую энергию друг другу по цепочке путём миграции — особого электромагнитного взаимодействия. В состав таких комплексов также входит хлорофилл а, но там можно встретить и множество других пигментов, в том числе и других хлорофиллов (см. рис. 5).
У всех высших растений в хлоропластах содержатся хлорофиллы а и b, отличающиеся лишь одной боковой группой (в хлорофилле а — метильная, в хлорофилле b — альдегидная группа). Хлорофилл b — дополнительный пигмент (помогает улавливать свет в более широком диапазоне длин волн).
У низших растений есть также хлорофилл с, у которого отсутствует фитольный хвост. Он обнаружен в некоторых «красных» пластидах водорослей (у динофлагеллят и бурых, например). Хлорофиллы d и f встречаются у цианобактерий; кроме того, известны четыре бактериохлорофилла: a, b, c и d, — которые содержатся в клетках аноксигенных фотосинтезирующих бактерий.
Каротиноиды
Следующая крупная группа фотосинтетических пигментов — каротиноиды (рис. 6).
Как вы можете видеть по схеме, это протяжённые молекулы, которые можно мысленно разбить на блоки по 5 атомов углерода, напоминающие молекулу изопрена. Поэтому каротиноиды — это изопреноиды. Максимум поглощения каротиноидов смещён относительно того, который характерен для хлорофиллов (рис. 7).
Такой спектр поглощения позволяет каротиноидам выполнять ряд очень важных функций, помогающих протекать процессу фотосинтеза эффективно и безопасно. Вот что делают каротиноиды в клетках растений:
- улавливают свет в составе антенн и помогают собирать энергию, недоступную хлорофиллам;
- позволяют реакционному центру сбросить лишнюю энергию (иначе она сбрасывается на кислород, который превращается в опасные свободные радикалы);
- нейтрализуют свободные радикалы, то есть являются антиоксидантами.
Это далеко не все функции каротиноидов, но уже по ним можно понять, насколько эти пигменты важны.
По химическому строению каротиноиды можно разделить на 2 большие группы — углеводороды каротины и окисленные углеводороды, содержащие кислород (ксантофиллы).
Каротины бывают линейные и циклические, содержащие β- и ε (эпсилон)- кольца (рис. 8). Для человека наиболее важны циклические формы, потому что при их метаболизме получается витамин А, необходимый для зрения.
α-каротин содержит 2 кольца: β и ε. Если говорить о практическом применении каротина, для большинства млекопитающих жизненное значение имеет лишь β-кольцо, преобразующееся в ходе физиологических процессов в ретиналь — компонент зрительного пигмента (входит в состав белка родопсина), отвечающего за сумеречное зрение.
β-каротин состоит из двух β-колец. Он намного более эффективно используется организмом. Для растений это крайне важный антиоксидант, предотвращающий образование форм синглетного кислорода. β-каротин также может служить донором электронов для Р680 при определенных обстоятельствах.
Лютеин синтезируется из α-каротина. У человека он накапливается в желтом пятне и уберегает сетчатку от синего и фиолетового излучения, обуславливая остроту зрения при избыточном освещении.
Как мы видим, молекулы пигментов обладают общими чертами, а некоторые очень похожи химически. Это делает процесс их выделения непростым и требует использования специальных высокоэффективных методов разделения, таких как хроматография.
Хроматография
первые точное представление о пигментах было получено благодаря работам русского ботаника Михаила Семёновича Цвета. Он разработал тонкослойную хроматографию — метод разделения веществ, основанный на разной способности молекул к адсорбции, — и выделил пигменты листа в чистом виде. Этот подход на этапе открытия был прорывным и до сих пор служит надёжным и точным способом разделения веществ.
В целом метод хроматографии основан на том, что смесь пропускают через некоторую специальную среду, в которой молекулы с разным строением задерживаются на разное время. Из-за этой разницы скоростей смесь разделяется на составляющие её вещества, причём различия между ними могут быть совсем небольшими — например, можно отчётливо разделить даже такие похожие молекулы, как хлорофиллы а и b.
Существует множество вариантов хроматографии. Например, гель-фильтрация разделяет молекулы по размеру (мелкие заходят в поры геля и дольше в нём задерживаются, а крупные нет), ионнообменная — по заряду (среда для разделения сама несёт заряд и связывает часть молекул лучше). Существует и аффинная хроматография (среда несёт специфические молекулы, узнающие какой-то компонент смеси). Для нас наибольший интерес представляет тонкослойная хроматография, так что мы рассмотрим этот метод подробнее.
Представим себе полосочку бумаги. Она состоит из молекул целлюлозы, которые всегда удерживают на себе тончайший слой воды. Если мы опустим кончик бумаги в бензин, то бензин благодаря капиллярным силам постепенно поднимется вверх, и тогда бумагу будет покрывать уже два слоя — тонкий слой воды и тонкий слой гидрофобного бензина. Теперь поместим на пути поднимающегося бензина капельку смеси пигментов. Благодаря гидрофобным взаимодействиям фронт бензина будет стараться увлечь пигменты за собой; однако, если молекулы имеют гидрофильные участки, они будут то и дело цепляться ими за слой воды и тормозиться (рис. 9). Таким образом, спустя какое-то время смесь разделится на полоски, содержащие разные пигменты.
сли говорить в терминах хроматографии, то слой воды представляет собой неподвижную фазу (связан с целлюлозой), а бензин — подвижную, или элюент. Вместо бензина можно использовать и другие вещества, в разной степени неполярные, что будет влиять на положение пятен на хроматограмме.
Для проведения хроматографии и анализа результатов необходимо держать в голове суть процесса и представлять себе строение компонентов смеси. Тонкослойная хроматография — излюбленное задание на олимпиадах, поэтому будет очень хорошо, если вы освоите этот метод и научитесь правильно интерпретировать его результаты. Для этого мы предлагаем вам небольшую инструкцию к проведению практимума.
Оборудование:
- Стакан.
- Крышка или блюдце.
- Нитка.
- Скотч.
- Листья. Лучше использовать листья с малым содержанием воды. В зимнее время содержание пигментов в листьях многих комнатных растений, как правило, заметно снижается, поэтому рекомендуется использовать листья петрушки, которую можно купить в магазине. Не годятся водянистые листья, а также утратившие яркую зеленую окраску, пожелтевшие. Петрушку можно заменить листьями гибискуса. Можно взять кожуру апельсина или мандарина, тогда будет наблюдаться все богатство каротиноидов.
- . Мел.
- 96%-й спирт.
- Бензин.
- Фильтровальная бумага (можно попросить в кабинете химии).
- Срезанная наискосок трубочка для коктейля (подойдет металлическое перо).
Ход работы
1. Для начала сделаем установку (рис. 10). Берем стакан, блюдце, нитку и скотч. Нитку приклеиваем поперек горлышка стакана (нитка — диаметр). Растворитель наливаем на дно сосуда слоем около 3 см, сосуд закрываем и ждем, пока стакан насытится парами растворителя (30–45 минут).
2. Листья мелко нарезаем и растираем в ступке с добавлением кварцевого мела в кашицу, налив 96%-й этиловый спирт. Если есть соли магния, то можно добавить и их, так как магний в центре порфиринового кольца при механическом воздействии может вываливаться, замещаясь на 2 катиона водорода, и можно получить феофитин, значительно снизив концентрацию хлорофилла. Готовую спиртовую вытяжку пигментов профильтровать через фильтровальную бумагу (немного бумаги нужно оставить!).
3. Берем фильтровальную бумагу и нарезаем полосками шириной примерно 2 см и длиной больше высоты стакана на 3–5 см.
4. Отчерчиваем линию старта (очень аккуратно и нежно чертим по линейке линию параллельно поверхности края полоски, отступив 1–1,5 см) и линию финиша (через 10 см от линии старта).
5. Наносим фильтрат с помощью коктейльной трубочки (пера) на линию старта. Стараемся, чтобы пятно было наименьшим по диаметру, повторяем три раза. Ждем, пока пятно высохнет, и опускаем полоску бумаги в раствор (подвешивая за нитку). Закрываем блюдцем, ждем, пока пигменты дойдут до линии финиша.
6. Анализируем.
На практическом туре олимпиады в 10 классе требовалось заполнить таблицу по результатам тонкослойной хроматографии. Давайте и мы с вами выполним данное задание.
Выполнив практическую часть, имеем хроматограмму — лист бумаги с пятнами разделившихся пигментов. Данный метод основан на разделении по сродству молекул к растворителю. Те молекулы, которые растворяются в данном элюэнте лучше, убегут дальше, и их Rf будет больше, а менее растворимые молекулы будут разгоняться очень медленно и останутся у самой линии старта.
Как же рассчитать Rf и что это такое?
Rf — отношение расстояния, которое «пробежала» данная молекула, к расстоянию, которое пробежала самая дальняя молекула. Проще говоря,
Точно предсказать величину Rf очень сложно. Она зависит от свойств фильтровальной бумаги, состава смеси растворителей, техники нанесения пигментов. Можно лишь сказать, что в данном случае для каротина Rf будет всегда больше, чем для хлорофиллов, а у хлорофилла а больше, чем у хлорофилла b. Точному определению Rf препятствует неровный контур пигментного пятна.
В таблице на рис. 11 представлена наиболее полная картина пигментов, которые вы можете найти на своей хроматограмме. Обязательно присутствуют: хлорофилл а, хлорофилл в, β-каротин, каротин/ксантофилл. Наличие пигментов может зависеть от многих факторов: концентрация пигментов в листе, качество приготовления спиртовой вытяжки и их концентрация в ней, свойства фильтровальной бумаги и другие. Если вы найдете 5 разных пятен пигментов, это будет прекрасно!
Источники:
- Лекции преподавателей Московского государственного университета по физиологии растений.
- Лекции и семинары преподавателей ЦПМ по физиологии растений. Сайт по физиологии растений.
- Некоторые изображения для статьи.
- Источник красивой картинки с рис. 11.
- Эстетичный сайт про эксперименты с детьми, в том числе бумажную хроматографию, и источник рис. 1.
Рекомендуемые материалы:
- Задания ВсОШ регионального этапа.
- Материалы ЦПМ по физиологии растений, особенно важны разделы про фотосинтез и тонкослойную хроматографию.
- Курс лекций Владимира Викторовича Чуба по физиологии растений.
- Учебник по физиологии растений под редакцией И.П. Ермакова.